常见的问题及可能原因分析
| 问题 | 可能原因 | 验证或解决办法 |
| 背景高 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100% 甲醇浸透膜5-10min |
| 洗膜不充分 | 增加洗液体积和洗涤次数 | |
| 阻断不充分 | 增加封闭液孵育时间，并使用蛋白酶抑制剂 | |
| 二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 | |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗、原因选择在有效期内、从而抑制高分子量蛋白的转移。有活性的酶联物 | |
| 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 设置阳性对照，或者提高温度。同时会使凝胶收缩或变硬，其他操作过程不变，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。如果阳性对照有结果，选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） | |
| 一抗的特异性不够 | 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，延长孵育时间 | |
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，避免长时间放置 | |
| 封闭过度 | 减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 | |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 | |
| 条带位置不对；或有非特异性条带 色带） | 二抗的非特异性结合 | 增加一个对照：不加一抗，保证抗体的特异性 |
| 蛋白降解 | 使用新鲜制备的标本，通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 | |
| 一抗失效 | 选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
| 膜没有完全均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 | |
| 靶蛋白分子量小于10Kd | 选择小孔径的膜，选择无交叉反应的封闭剂。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 | |
| 转移时间不够 | 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 | |
| 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度， | |
| 试剂不匹配 | 一抗与组织种属，延长孵育时间 | |
| 标本中靶蛋白含量太低 | 增加标本上样量。缩短转移时间 | |
| 甲醇浓度过高 | 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，如果不显色则说明酶失活了。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 | |
| 没有阳性条带，二抗）浓度，
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